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離心機(jī)在休止細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用

更新時(shí)間:2024-02-20 00:00:00瀏覽:3195次

  離心機(jī)是利用離心力,分離液體與固體顆粒或液體與液體的混合物中各組分的機(jī)械。離心機(jī)主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開(kāi),或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同,又互不相溶的液體分開(kāi)(例如從牛奶中分離出奶油);它也可用于排除濕固體中的液體,例如用洗衣機(jī)甩干濕衣服;特殊的超速管式分離機(jī)還可分離不同密度的氣體混合物;利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點(diǎn),有的沉降離心機(jī)還可對(duì)固體顆粒按密度或粒度進(jìn)行分級(jí)。離心機(jī)就是利用離心力使得需要分離的不同物料得到加速分離的機(jī)器。離心機(jī)應(yīng)用于化工、石油、食品、制藥、選礦、煤炭、水處理和船舶等部門(mén)。過(guò)濾式離心機(jī)的主要原理是通過(guò)高速運(yùn)轉(zhuǎn)的離心轉(zhuǎn)鼓產(chǎn)生的離心力(配合適當(dāng)?shù)臑V材),將固液混合液中的液相加速甩出轉(zhuǎn)鼓,而將固相留在轉(zhuǎn)鼓內(nèi),達(dá)到分離固體和液體的效果,或者俗稱(chēng)脫水的效果。
  離心機(jī)在休止細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用:
  休止細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行需要用到離心機(jī)。
  因?yàn)樵诩?xì)胞制備階段細(xì)菌收集過(guò)程中離心分離提取細(xì)胞。
  休止細(xì)胞又稱(chēng)靜息細(xì)胞,把培養(yǎng)液中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時(shí)間,以消耗內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),呈饑餓狀態(tài)的細(xì)胞,在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應(yīng)用。它的主要特性就是細(xì)胞雖然處于休眠狀態(tài),不進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,但仍含有各種酶系,具有氧化和發(fā)酵能力,在適宜條件下可再恢復(fù)生長(zhǎng)。另外休止細(xì)胞反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng),可以提高底物轉(zhuǎn)化率,不易染雜菌,可以減少產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶合成的抑制。
  休止細(xì)胞的制備:
  (1)菌株的活化
  用接種環(huán)將實(shí)驗(yàn)所需的E. coli CVCC 249接種到已滅菌的固體斜面培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18—24 h。
  (2)菌株的獲得
  用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取適量菌轉(zhuǎn)接至液體三角瓶中,恒溫振蕩培養(yǎng)箱37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD > 1.(大約1.4左右)。
  (3)細(xì)菌的收集
  將培養(yǎng)好的細(xì)胞菌液放入離心管中,離心機(jī)4500 rpm 離心收集細(xì)胞,棄去上清培養(yǎng)液,用生理鹽水洗滌,洗去培養(yǎng)液,之后離心機(jī)4500 rpm離心收集細(xì)胞,重復(fù)洗滌三次至上清液透明,棄去上清液。
  (4)菌懸液的制備
  將離心后的細(xì)胞用pH 為7.0 的磷酸緩沖液定量至25 mL,吹懸混勻,為以后實(shí)驗(yàn)使用。
  (5)休止細(xì)胞的制備
  菌懸液放置在4 ℃條件下放置72 h 后,在37 ℃培養(yǎng)4—8 h,休止細(xì)胞制備完成,放在4 ℃冰箱中備用。
  脫氫酶活性的測(cè)定:
  (1) 在5 mL的離心管中加入1 mL反應(yīng)底物,并根據(jù)底物設(shè)置不同的濃度(同一濃度不同底物對(duì)細(xì)胞脫氫酶活性影響,如表1所示。不同稀釋度的各種底物對(duì)細(xì)菌脫氫酶降活性影響,我們做了三種底物的實(shí)驗(yàn),分別是乙酸鈉,琥珀酸鈉和檸檬酸鈉,如表2,表3和表4所示)。
  (2) 加入制備的休止細(xì)胞0.4 mL,用等體積的5%甲醛處理30 min滅活的細(xì)胞懸液作為對(duì)照。在加入細(xì)胞之前一定注意將休止細(xì)胞搖勻后再加。
  (3) 加入MTT 40 μL ,震蕩搖勻,此時(shí)的溶液應(yīng)呈黃色,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃避光保溫2 h。
  (4) 加入二甲基亞砜1.3 mL,震蕩混勻后,37 ℃保溫30min ,此時(shí)溶液呈深藍(lán)紫色。
  (5) 加入PBS (pH 7.0)1.5 mL,振蕩混勻。
  (6) 722分光光度計(jì)測(cè)510 nm的OD ,每個(gè)樣品濃度至少要進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn),變異系數(shù)(coefficient of variation ,CV) 小于5%。
  酶活性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。任何一個(gè)酶都有催化一定底物進(jìn)行特定反應(yīng)的能力,但是酶的催化能力的測(cè)定實(shí)際上只能通過(guò)測(cè)定酶催化反應(yīng)速度來(lái)實(shí)現(xiàn)。酶催化反應(yīng)速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。而酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。另外,在研究酶促反應(yīng)時(shí),底物一般是過(guò)量的,因此一般測(cè)定產(chǎn)物的增加量較合適些。由于酶催化反應(yīng)速度受溫度、pH、離子強(qiáng)度及底物等諸多因素的影響,我們所謂的酶活性都是只在特定的系統(tǒng)和條件下測(cè)到的反應(yīng)速度,因此在測(cè)定酶活性時(shí),一定要注明這些特定的條件。即使同樣的酶,甚至用同樣的測(cè)定方法和同樣的單位定義,由于條件稍有不同,也會(huì)使測(cè)到的酶活性難以比較。因此,要比較各篇文獻(xiàn)報(bào)道或者不同牌號(hào)制劑的某種酶活性時(shí),必須注意它們的單位定義和測(cè)定系統(tǒng)及條件,千萬(wàn)不能盲目比較。
  與酶活性相關(guān)的另一個(gè)概念是“比活”,食指單位重量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活性,是純度量度,單位為u/mg。比活越高則酶越純。

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